来源：水木济衡

作者：王军

        校准物的生产工艺一般为：称量→配制→过滤→分装→冻干（适用于冻干品）→轧盖→贴标→定值→包装，其中称量、配制、冻干、定值是主要工艺控制点，特别是冷冻干燥，其投入大、过程复杂、控制点多、对时间和人员要求高，但冷冻干燥能极大延长产品的效期，并方便贮存和运输，在校准物和质控物的生产上得到广泛应用。质量控制过程包括原料检验、半成品检验、成品检验。

在校准物研制过程中，要考虑基质、项目、浓度、定值等因素。二十多年前，校准物大都为一些缓冲液基质，为了克服基质效应，目前越来越多的校准物使用与临床样本近似的基质。在这里想要说明的是，有的项目基质效应影响并不大，再加上咱们国家一直对血液管理非常严格，因此只要能提供数据证明基质效应的影响可以接受，应鼓励厂家使用动物血清基质或者缓冲液基质的校准物、质控物。在校准物的项目选择上，临床为了使用方便和成本考虑，目前比较倾向使用复合的校准物，但是大组合会添加更多的成分，制备难度加大、组分间的干扰风险增大，因此酶类、酯类、甲功、肿标等小组合也是不错的选择。在设计校准物的浓度时，应充分考虑临床实际应用，结合项目的参考区间和医学决定水平制定，具有诊断价值的浓度点不宜使用校准浓度外推方法。

       校准物属于参考物质（RM）的范畴，因此也应具备三大特点：稳定、均匀、带有不确定度的特性值。校准物在设计开放阶段就要考虑稳定性，一般要确定效期稳定性、运输稳定性和使用稳定性。在确定校准物效期时，可以参考ISO 导则35，同时校准物作为应用层面的参考物质，属于医疗器械管理，也可以参考YY/T 1579《体外诊断医疗器械 体外诊断试剂稳定性评价》（等同转化ISO23640）。在研发阶段，当预测产品的效期、比较不同配方或包装的效果、评估产品配方或生产工艺改变的影响的时候，可以使用加速稳定性，达到加快选择产品配方、包装，从而提高研发效率、缩短研发周期的效果，但是加速稳定性代替不了实时稳定性，产品一定要做实时稳定性的监测和验证。关于校准物的均匀性，可以参考ISO 导则35。

      图1是ISO 17511：2020中的溯源模式1，图中红框部分，从p4到m5就是制造商需要完成的。p4制造商选定测量程序（manufacture’s selected measurement procedure），应是一个或多个现有的一级或二级校准物校准的测量系统，如果该项目现有公布的二级参考测量程序，最好选用参考测量程序，厂家可以在内部建立参考测量程序，更鼓励厂家利用现有的外部参考测量实验室。m3校准p4给m4制造商工作校准物（working calibrator，又被称为制造商主校准物、内部校准物）赋值。厂家一定要建立工作校准物吗？理论上可以没有，可以直接用参考测量系统来校准产品校准物、甚至直接校准试剂盒，但是大家想想，这样现实吗？肯定不现实！所以才有工作校准物的存在。P5制造商常设测量程序（manufacture’s standingmeasurement procedure），p5一般与常规测量程序相同，但是厂家要通过大量的重复测定和严格的控制措施来实现较低的测量不确定度。m4校准p5给m5终端用户校准物（end-use IVD MD calibrator）赋值。

图1完整的校准物赋值过程

在校准物赋值的过程中，有下面几点需要强调和注意：

—工作校准物的值是调整出来的，不是上一级参考物质校准测量程序直接得到的。m3校准p4给m4赋值，得到的这个值就直接作为工作校准物的校准值吗？由于工作校准物与实际临床样本还是有差异的，而我们最终都是服务于临床患者样本，因此这个值不是最终的校准值，只能作为初始赋值。制造商要使用参考测量程序去测试一组病人样本（通常5～10个不同浓度的pools），再同时用工作校准物得到的初始赋值去校准常规测量程序测试这同一组病人样本，如果这两组值接近（预先设定可接受标准，例如回归曲线的相关系数、斜率、截距等），那工作校准物的赋值是有效的，如果不接近，则需要调整工作校准物的赋值，直到接近为止（如果工作校准品的基质不接近临床样品，无论怎么调整，是调整不过来的，这就解释了为什么一再强调工作校准物的互换性）；

—产品校准物的值也是调整出来的。用m4校准p5给产品校准物赋值，得到的这个值也不能直接作为产品校准物的校准值，制造商要使用工作校准物校准常规测量程序去测试一组病人样本，再同时用产品校准物得到的初始赋值校准常规测量程序去测试同一组病人样本，如果这两组值接近（预先设定可接受标准，例如回归曲线的相关系数、斜率、截距等），那产品校准物的赋值是有效的，如果不接近，则需要调整产品校准物的赋值，直到接近为止；

—校准物的值是有检测系统专用性的。从溯源图上能看出，校准物的赋值是离不开试剂+仪器的测量程序的固定组合的，因此无论是工作校准物还是产品校准物，如果适用于多个检测系统，则应有不同的校准值。

    上面是一个完整的传递过程，非常复杂。在实际过程中，上述过程往往会简化，见图2，没有m3和p4，从p3直接到m4，m4工作校准物是临床样本panels或pools，或者直接是临床样本，这些样本与临床样本具有最大的相似性，因此通过p3参考方法给m4的赋值就不用再调整，这样省去了很大的工作量。产品校准物的定值过程同第一种情况。

图2 简化的校准物赋值过程

     使用有证标准物质给校准物赋值，见图3。用有证标准物质校准检测系统后测定工作校准物，得到工作校准物的初步赋值。在分析仪上选定2个通道，一个通道以有证标准物质校准，另一个通道以初步赋值的工作校准物校准，然后测试同一组病人样本，如果这两组值接近（预先设定可接受标准，例如回归曲线的相关系数、斜率、截距等），那工作校准物的赋值是有效的，如果不接近，则需要调整工作校准物的赋值，直到接近为止。产品校准物的定值过程同第一种情况。

图3 使用CRM给校准物赋值的过程

     在这里，给大家推荐Søren Blirup-Jensen、A. Myron Johnson、Marianne Larsen1等专家2001年在Clin Chem Lab Med杂志上发表的《蛋白标准化》的系列文章，特别是第四篇《Protein standardization IV: Value Transfer Procedurefor the Assignment of Serum Protein Values from a Reference Material to aTarget Material》。文章里介绍了给参考物质定值，特别是免疫类项目的参考物质定值的一种方法即“靶值转移程序”。由于该篇文章内容较多、较复杂，在这里不详细介绍了，大家如有需要我后续可再写小文章。下面，我只介绍这篇文章的关键点。我们通常用与CRM直接比较的方式给下一级校准物定值（即上面的第三种情况），但是，如果CRM的基质与下一级校准物基质不一样、浓度不一样，这样直接定值可能就会引起一定问题（第六篇提到二级标准物质可以用与一级标准物质进行比较测量的方法定值，这也是有条件的，即基质相近、浓度相当，说得就是这个道理）。“靶值转移程序”的基本原理是称重稀释，多点测定，线性回归。“靶值转移程序”又分为2种途径，途径1：从一个血清蛋白制备物到另一个血清蛋白制备物的靶值转移程序（直接靶值转移），见图4；途径2：从一个纯的蛋白制备物到一个血清蛋白制备物的靶值转移程序（间接靶值转移）。每种途径都有其操作程序和数学模型，其中要注意的是：CRM和校准物的复溶、稀释等过程采用称重法，以降低不确定度；不同稀释梯度溶液要进行密度校正；CRM和校准物要有多个稀释梯度，且浓度近似；分不同天进行，且每天校准用的校准物要新配制；采用合适的统计学方法。

图4 靶值转移程序大致过程

     这种情况即ISO 17511：2020里的模式6，见图5。m3往往是制造商自己制备或外购的纯化的生物标志物，如待测的抗原或抗体。p4制造商选定测量程序可以是这些抗原或抗体的配制程序，也可以是测这些抗原或抗体的常规测量程序，但要标准化、固定化，以减少不确定度。m4工作校准物可以是带基质的，也可以是其他基质，也可以用临床样本panel或pool组成。经常有同仁问道“企业如何建立自己的内部标准？”其实这种情况，没有标准，您的就是标准，大家记住一个原则“做我所写，写我所做，说与做一致，知与行合一”。

图5 厂商建立标准的过程

      上面介绍了校准物的赋值，下面再说说测量不确定度。在检验医学中测量程序的可靠性一直主要用术语随机测量误差和系统测量误差，分别以不精密度和偏倚来表征。当前计量界对被测量的演变，由传统上临床化学使用的误差方法到基于测量结果不确定度的方法。不确定度在涉及患者结果与临床参考值比较的情况下，显得尤为重要。举例来说，HbA1c的参考区间为4%～6%，三位患者测的结果分别为3.9%、4.1%、6.2%，那到底是正常还是异常？如果直接作比较是有风险的，科学的做法是比较时考虑测量不确定度。与误差方法相比，测量不确定度可以传递和累积，这也是其应用的优势之一。ISO 15189要求实验室确定并文件化他们测量结果的不确定度。关于医学实验室测量不确定度评定，可以参考ISO/TS 20914:2019 《Medicallaboratories——practical guidance for the estimation of measurement  uncertainty》，这也是ISO/TC212新发布的一个标准，以配合ISO 15189的实施。医学实验室测量结果不确定度的一个来源是所使用的产品校准物的测量不确定度。因此应客户要求，厂家应将产品校准物的测量不确定度的相关信息提供。产品校准物赋值的测量不确定度是与其溯源密切相关的，溯源链上的每一个校准物、每一个校准程序都会引入不确定度，产品校准物赋值的测量不确定度就是上述分量的合成。溯源解决的是测量正确度的问题，如果仅仅追求量值溯源，不对每一校准传递步骤进行严格控制并降低测量不确定度，最终也不能实现测量结果准确可比的目的。

      最后还要强调一下溯源确认（validationof metrological traceability）。校准物完成赋值以后，不是就此结束了，还应进行溯源确认的这个工作，因为试剂、仪器、校准物组成的检测系统是测量患者标本的，“溯源确认”简单地理解就是用患者标本进行方法学比对（有参考方法，就与参考方法比；没有参考方法，可与用CRM校准的常规方法比对；若CRM也没有，校准物溯源到内部标准，这种情况就谈不上溯源确认，厂商做的工作就是标化好自己的程序，尽量减少各环节的不确定度）。

在校准等级链上步骤最多的工作都是由厂家来完成的，临床测量结果的溯源也是依靠产品校准物的溯源来实现的，产品校准物起着承上启下的作用，意义重大，厂家应扎扎实实做好产品校准物的量值溯源工作。